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细胞自噬染色检测试剂盒(MDC法)/细胞自噬染色检测试剂盒(MDC法)
来自 : Fluorochrome价格 发布时间:2021-09-23

一、实验材料1、宿主细胞CHO(贴壁细胞)2、脂质体LIPOFECTAMINE 2000(invitrogen公司)3、6孔细胞培养版4、无血清培养基OPTI-MEM(GIBICO)5、转染级质粒二、实验步骤invitrogen的LIPOFECTAMINE 2000说明书上列举了24孔、12孔、6孔......板的实验体系,因为需要转染的细胞量大,所以一直采用的是6孔版做的转染。以下是以6孔板为例说明一下我的体系和方法吧!1、转染前一天,以合适的细胞密度接种到6孔培养板上。(我的接种密度是3~4*105/ml.)转染时,细胞要达到90~95%的融合。2、溶液1:240ul 无血清培养基 + 10 ul lipofectamine 2000 per well (总体积250 ul)(温育5min)3、溶液2:X ul 无血清培养基 + 4 ug 质粒 per well(总体积250 ul)4、将溶液1与溶液2混合,室温下置20min。5、与此同时,将6孔板中的细胞用无血清培养基冲洗细胞两遍后,加入2ml 无血清培养基。6、将溶液1与溶液2的混合液逐滴加入孔中,摇动培养板,轻轻混匀。在37℃,5%的CO2中保温5~6小时。7、6小时后,更换含有血清的全培养基,在37℃,5%的CO2中48~72h检测转染水平。8、如果做稳定转染,换全培养基培养后24h,即可以1:10或更高的稀释比例(根据细胞的生长情况)接种到新的培养板,加抗生素进行筛选。三、个人经验:我觉得贴壁细胞的脂质体转染还是很容易的,有了经验之后,现在做转染得心应手,转染前后细胞的形态几乎不发生变化,几乎没有细胞死亡。转染率很高。以下是个人经验,与大家分享。1.细胞的状态。这点非常重要,不要急于求成,一定要让细胞处于最佳的生长状态再做。有文献说传代不要超过17代。我总是在细胞复苏后的3代左右做,那时细胞状态最好,不要用传了很多代的细胞去做,细胞的形态都会发生变化了。2.细胞的融合度。细胞的融合度必须要达到90%才能做,细胞太少,容易死的。3.无血清培养基OPTI-MEM(GIBICO)很好用,有条件的话,就用它代替PBS洗细胞两遍(我曾比较过OPTI-MEM与PBS或无血清的DMEM,前者的转染效率确实高)。注意洗的时候要轻,靠边缘缓缓加入液体,然后不要吹吸细胞,而是转动培养板让液体滚动在细胞表面。如果洗的太厉害,细胞又损失一部分,加了脂质体后,细胞受影响就更大了,死亡细胞会增多。4.加入无血清培养基后5~6小时更换全培养基。无血清培养基培养时间过长,对细胞是有毒性的,这里有血的教训!5.转染的质粒一定纯度好、浓度高、无内毒素。浓度不要低于0.35ug/ul。低浓度的质粒,我做的结果都不好。6.48小时mRNA表达最高;72h蛋白表达最高。

本文链接: http://fluorochrome.immuno-online.com/view-689325.html

发布于 : 2021-09-23 阅读(105)
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